Molekylärbiologiska forskningsmetoder och deras användning

Molekylärbiologiska forskningsmetoder spelar en viktig roll inom den moderna medicinen, kriminalteknik och biologi. Tack vare framsteg i studien av DNA och RNA, är i stånd att utforska genomet av organismen bestämma det orsakande medlet, för att känna igen den önskade nukleinsyran i en blandning av syror, etc. personen

Molekylär-biologiska metoder. Vad är det?

Tillbaka i 70-80 av forskarna var först med att dechiffrera det mänskliga genomet. Denna händelse gav impulser till utvecklingen av genteknik och molekylärbiologi. Studie av egenskaper hos DNA och RNA har inneburit att det nu är möjligt att använda dessa nukleinsyror för ändamålet att sjukdomsdiagnos, studera genen.

Framställning av DNA och RNA

Molekylärbiologiska diagnostiska metoder kräver utgångsmaterial: ofta denna nukleinsyra. Det finns flera sätt att välja dessa substanser från cellerna i levande organismer. Var och en har sina fördelar och nackdelar, och det bör övervägas när man väljer ett förfarande för isolering av nukleinsyror i ren form.

1. Framställning av DNA genom Marmur. Metoden består i att behandla blandningen av alkoholsubstanser, fällningar erhållna rent DNA. Nackdelen med denna metod är användningen av frätande ämnen, fenol och kloroform.

2. Isolering av DNA på bommen. Huvud ämne som används här - är guanidintiocyanat (GuSCN). Det främjar avsättningen av deoxiribonukleinsyra på specialiserade substrat, från vilket den kan efter hand insamlade med hjälp av en speciell buffert. Emellertid GuSCN - är en inhibitor av TCP, och även en liten del av denna får deponeras i DNA kan påverka utvecklingen av polymeraskedjereaktionen, vilket är viktigt när man arbetar med nukleinsyror.

3. Utfällning av föroreningar. Metoden skiljer sig från tidigare i det att molekylerna i sig inte är deponerade dehoksiribonukleinovoy syra och föroreningar. För att göra detta, använd jonbytare. Nackdelen är att inte alla ämnen kan lösa.

4. Mass screening. Denna metod används i de fall då du inte behöver ha korrekt information om strukturen av DNA-molekylen, och behovet av att få en del statistik. Anledningen är att nukleinsyran strukturen kan skadas vid hantering av rengöringsmedel, i synnerhet alkalier.

Klassificering av forskningsmetoder

Alla molekylärbiologiska metoder för forskning är uppdelade i tre större grupper:

1. Amplifiering (med användning av ett flertal enzymer). Detta inkluderar PCR - polymeraskedjereaktion, som spelar en viktig roll i många av de diagnostiska metoder.

2. Neamplifikatsionnye. Denna grupp av metoder är associerad direkt med arbetet av nuklein-syrablandningar. Exempel är 3 sorters blottar, in situ-hybridisering, etc.

3. Metoder baserade på erkännandet av signalen från sondmolekylen, som binder till en specifik DNA- eller RNA-prob. Exempel - hybridisering systemet Hybrid Capture Systemlösning (hc2).

Enzymer som kan användas i molekylärbiologiska forskningsmetoder

Många molekylära diagnostiska tekniker involverar användningen av brett spektrum av enzymer. Nedan används oftast:

1. restriktionsenzym - "cut" DNA-molekylen till de nödvändiga delarna.

2. DNA-polymeras - syntetiserar en dubbelsträngad deoxiribonukleinsyra molekyl.

3. Omvänd transkriptas (omvänt transkriptas) - används för att syntetisera DNA från en RNA-mall.

4. DNA-ligas - är ansvarig för bildningen av fosfodiesterbindningar mellan nukleotidema.

5. exonukleas - avlägsnar nukleotider från änddelarna av den deoxiribonukleinsyramolekyl.

PCR - den grundläggande metoden för DNA-amplifiering

Polymeraskedjereaktion (PCR) används ofta i modern molekylärbiologi. Denna metod, i vilken en enda DNA-molekyl kan erhållas ett stort antal kopior (förstärkning molekyl).

De viktigaste funktionerna i PCR:

- diagnos av sjukdomar;

- kloning av DNA-segment, Gene.

För utförande av en polymeraskedjereaktion kräver följande element: initial DNA-molekyl, ett termostabilt DNA-polymeras (Taq eller Pfu), deoxiribonukleotid fosfater (källor till kvävebaser), primrar (två primer en DNA-molekyl) själv buffra systemet, som kan genomföra alla reaktioner.

PCR består av tre steg: denaturering, primerhybridisering och förlängning.

1. denaturering. Vid en temperatur på 94-95 grader Celsius proshodit bryta vätebindningar mellan de två kedjorna av DNA, och som ett resultat får vi två enkelsträngade molekyler.

2. parade primrama. Vid en temperatur på 50-60 grader Celsius inträffar anslutnings primers vid ändarna av enkelsträngade nukleinsyramolekyler enligt den typ av komplementaritet.

3. Töjning. Vid en temperatur av 72 grader syntetiseras dotter dubbelsträngad deoxiribonukleinsyramolekyler.

DNA-sekvensering

Molekylärbiologiska forskningsmetoder kräver ofta kunskap om sekvensen av nukleotider i en molekyl av deoxiribonukleinsyra. För att bestämma genetiska koden sekvenseras. Molekylär diagnostik i framtiden kommer att baseras på kunskap i bestämningen av den humana sekvensen.

Följande typer av sekvense:

• sekvensering genom Maxam-Gilbert-;
• Sanger-sekvensering;
• pyrosekvensering;
• nanoporovoe sekvensering.